無細胞翻訳系を用いたタンパク質進化に関する2つのプレプリントをbioRxivで公開しました
- Naohiro Terasaka
- 21 分前
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以下の二つのプレプリントをbioRxivに公開しました。東京大学大学院工学系研究科の古林太郎研究員との共同研究になります。
Boosted cell-free gene expression for robust signal readout from a single-copy DNA template in microdroplets
Efficient cell-free evolution of RNA polymerases by droplet microfluidics
従来の分子進化は、DNAクローニングや細胞の形質転換、培養工程に依存しており、スピードとスループットに制約がありました。
本研究では、数百fMのDNAからのタンパク質発現が可能なboosted PURE系を構築し、ピコリットルドロップレット中での単一DNA検出を実現しました。
このBoosted PURE系とドロップレットスクリーニング系を組み合わせることで、完全無細胞のタンパク質進化（PURE-FADSプラットフォーム）が可能になります。PURE-FADSでは、1日で約百万種類のタンパク質の活性スクリーニングが可能になります。
このプラットフォームを用いて、SP6 RNA polymeraseの活性向上進化を行いました。野生型SP6 RNAPは塩濃度依存性が高く、cell-free系や細胞内での応用に制限があります。本研究で進化したSP6 RNAP-v3は高塩濃度条件のPURE系でも高活性を示し、哺乳類細胞内でも機能しました。
さらに、PURE-FADSプラットフォームを用いて、分割型SP6 RNAPを進化させ、近接依存型転写バイオセンサー（spSP6 RNAP-v4)を構築しました。従来のsplit T7系と異なり、in vitroでほぼバックグラウンドゼロを達成し、T7 RNAPとの直交性も維持しています。spSP6 RNAP-v4はタンパク質相互作用、抗体結合、RNA、小分子検出などに応用可能です。
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